U suradnji s Institutom za znanost i tehnologiju Austrija (ISTA), objavili smo u časopisu Nature prvu metodu koja koristi svjetlosnu mikroskopiju za sveobuhvatno mapiranje svih neurona i njihovih veza unutar uzorka moždane tvari. Ključni rezultat ovog eksperimenta je da ova metoda funkcionira jednako dobro kao i connectomics temeljen na elektronskoj mikroskopiji.
Razvoj svjetlosne mikroskopije
U 1660-im godinama, nizozemski trgovac tkaninama Antoine van Leeuwenhoek koristio je jednostavni, domaći svjetlosni mikroskop koji je povećavao uzorke više od 250 puta. Time je postao prva osoba koja je dokumentirala blizak pogled na bakterije, crvene krvne stanice, spermatozoide i mnoge druge znanstvene prizore. Od tada, svjetlosna mikroskopija postala je temeljna tehnika u našem nastojanju da razumijemo žive organizme. Danas je gotovo svugdje prisutna u laboratorijima životnih znanosti, omogućujući biologima da identificiraju i karakteriziraju stanice, organe i tkiva te dijagnosticiraju mnoge bolesti.
Izazovi u connectomicsu
Iako je svjetlosna mikroskopija široko korištena, nije uspjela prodrijeti u područje connectomicsa — grane neuroznanosti u kojoj je Google dao temeljne doprinose tijekom proteklih deset godina. Napori za sveobuhvatno mapiranje svih neurona u određenom području, uključujući naš prethodni rad na connectomicsu, oslanjali su se na tehniku elektronske mikroskopije, koja može uhvatiti izuzetno blizak pogled na strukturne informacije unutar stanice. Međutim, elektronska mikroskopija ima značajnu manu: zahtijeva skupu, visoko specijaliziranu opremu koja nije lako dostupna većini laboratorija neuroznanosti.
LICONN: Inovativna metoda
U suradnji s kolegama iz ISTA, objavili smo rad pod nazivom Rekonstrukcija connectomike na bazi svjetlosne mikroskopije u moždanoj tvari sisavaca, u kojem predstavljamo prvu metodu korištenja svjetlosne mikroskopije za sveobuhvatno mapiranje svih neurona i njihovih veza unutar uzorka moždane tvari miša. To smo postigli prilagodbom nekoliko dobro uspostavljenih i validiranih tehnika te njihovim kombiniranjem u jedinstveni radni proces koji nazivamo LICONN (light microscopy-based connectomics). Naši kolege iz ISTA vodili su ključnu inovaciju projekta — protokol koji fizički širi moždano tkivo dok istovremeno očuva strukturnu cjelovitost, a istovremeno kemijski označava sve proteine kako bi se osigurala kontrastna slika potrebna za praćenje neurona i otkrivanje drugih staničnih struktura poput sinapsi.
Validacija LICONN-a
Radili smo s ISTA na detaljima protokola, primjenjujući našu paletu alata za analizu slika i strojnog učenja (ML) za connectomics, te na kraju validirali LICONN na velikoj skali pružajući automatsku rekonstrukciju gotovo milijun kubičnih mikrona volumena korteksa miša. Zatim smo sveobuhvatno provjerili praćenje svih ~0.5 metara neurita smještenih unutar manjeg volumena tkiva hipokampusa miša, pokazujući da LICONN funkcionira usporedivo dobro kao connectomics temeljen na elektronskoj mikroskopiji. Također smo pokazali da LICONN otvara mogućnost istovremenog mjerenja strukturnih i molekularnih informacija u uzorku tkiva, što će omogućiti fundamentalne nove prilike za razumijevanje funkcioniranja mozga.
Prednosti svjetlosne mikroskopije
Connectomics koristi mikroskopsku sliku u kombinaciji s računalnom obradom za rekonstrukciju pojedinačnih stanica i njihovih složenih veza unutar moždane tvari. Ključna prednost svjetlosne mikroskopije je njena sposobnost hvatanja svjetlosti na mnogim različitim valnim duljinama, što istraživačima omogućuje vizualizaciju raznih fluorescentnih markera za proteine, neurotransmitere i druge molekule koje pružaju tragove o tome kako neuroni i cirkuli funkcioniraju ili ne funkcioniraju. LICONN omogućuje usklađivanje ovih molekularnih markera s detaljnim strukturnim kartama neuronalnih puteva s neviđenom preciznošću i lakoćom, što će pomoći u stjecanju važnih uvida u to kako mozak generira kogniciju, percepciju i ponašanje.
Širenje mogućnosti
Kako bismo zaobišli problem ograničene rezolucije svjetlosne mikroskopije, naši kolege iz ISTA usmjerili su svoje napore prema uzorku samom. Koristili su tehniku poznatu kao ekspanzijska mikroskopija, koja koristi tvar nazvanu hidrogel (isti materijal koji čini pelene upijajućima). Hidrogeli upijaju vlagu povezivanjem s molekulama vode, nabreknući dok to čine — princip koji su istraživači u Boydenovom laboratoriju na Massachusetts Institute of Technology koristili za razvoj protokola za ekspanziju tkiva za mikroskopiju 2015. godine.
Iako se ekspanzijska mikroskopija danas koristi u mnogim laboratorijima, postojeći protokoli ekspanzije tkiva ne očuvaju tkivo dovoljno dobro za praćenje gusto označenih neuronalnih struktura, pa su naši suradnici iz ISTA razvili novi protokol ekspanzije za LICONN. Ovaj protokol uključuje prvo rezanje malog bloka tkiva na dijelove debljine 50 mikrometara, a zatim tretiranje svake sekcije s posebnim kemikalijama koje omogućuju širenje tkiva bez gubitka strukturne integriteta.
Zaključak
LICONN predstavlja značajan napredak u području neuroznanosti, omogućujući istraživačima da bolje razumiju složene neuronske mreže i njihove veze. Ova inovativna metoda ne samo da olakšava pristup istraživačima koji nemaju pristup skupoj elektronskoj mikroskopiji, već također otvara nove mogućnosti za istraživanje funkcionalnosti mozga i njegovih mehanizama. U 2026. godini, očekuje se da će LICONN postati standardna metoda u mnogim neuroznanstvenim laboratorijima, omogućujući brže i preciznije istraživanje neuronskih veza.
Česta pitanja (FAQ)
Što je LICONN?
LICONN je metoda koja koristi svjetlosnu mikroskopiju za sveobuhvatno mapiranje neurona i njihovih veza unutar uzorka moždane tvari.
Koje su prednosti svjetlosne mikroskopije u neuroznanosti?
Svjetlosna mikroskopija je pristupačnija od elektronske mikroskopije i omogućuje vizualizaciju različitih molekula u tkivu, što pomaže u razumijevanju funkcije neurona.
Kako ekspanzijska mikroskopija poboljšava analizu tkiva?
Ekspanzijska mikroskopija omogućuje povećanje uzoraka tkiva bez gubitka strukturne integriteta, što olakšava praćenje gusto označenih neuronskih struktura.
Koje su glavne primjene LICONN-a?
LICONN se može koristiti za istraživanje neuronskih mreža, razumijevanje kognicije i percepcije, te dijagnosticiranje neuroloških poremećaja.
Kako LICONN uspoređuje s elektronskom mikroskopijom?
LICONN pruža slične rezultate kao elektronska mikroskopija, ali je pristupačniji i lakši za korištenje u većini laboratorija.
