Nova svjetlost na neuralnim vezama

7. svibnja 2025.
Michał Januszewski, istraživački znanstvenik, i Viren Jain, istraživački znanstvenik

U suradnji s Institutom znanosti i tehnologije Austrije (ISTA), objavili smo u časopisu Nature prvi metodu za korištenje svjetlosne mikroskopije za potpuno kartiranje svih neurona i njihovih veza u bloku mozga. Ključni nalaz iz ove provjere je da se ovaj pristup jednako dobro ponaša kao i elektronska mikroskopija temeljena na konektomici. Brzi linkovi Paper × U 1660-ima, pomoću jednostavne, samoradne svjetlosne mikroskopije koja je povećavala uzorke više od 250 puta, nizozemski tkalac Antoine van Leeuwenhoek postao je prva osoba koja je dokumentirala bliski pogled na bakterije, crvene krvne stanice, spermijske stanice i mnoge druge znanstvene vidike. Od tada, svjetlosna mikroskopija utvrdila je svoje mjesto kao temeljna tehnika u našem potrazi za razumijevanjem živih organizama. Danas je gotovo sveprisutna u životnoznanstvenim laboratorijima, omogućujući biologima da identifikuju i karakteriziraju stanice, organe i tkiva te dijagnosticiraju mnoge bolesti. Jedan područje koje svjetlosna mikroskopija nije uspjela prodirati je konektomika – područje neuroznanosti u kojem je Google u posljednjih deset godina dao temeljna doprinosa. Pokušaji potpnog kartiranja svih neurona u području – uključujući naš prethodni rad u konektomici – umjesto toga su se oslanjali na tehniku zvanu elektronska mikroskopija, koja može uhvatiti vrlo bliski pogled na strukturalne informacije unutar stanice. Elektronska mikroskopija ima veliku ograničenost: zahtijeva skupu, visoko specijaliziranu opremu koja nije lako dostupna većini neuroznanstvenih laboratorija. Danas, u suradnji s kolegama iz Instituta znanosti i tehnologije Austrije (ISTA), objavili smo u časopisu Nature “Light-microscopy based connectomic reconstruction of mammalian brain tissue”, u kojem izvještavamo o prvoj metodi za korištenje svjetlosne mikroskopije za potpuno kartiranje svih neurona i njihovih veza u bloku mozga miša. Postigli smo to prilagođavanjem nekoliko dobro utvrđenih i potvrđenih tehnika i njihovim kombiniranjem u jedan radni tok koji nazivamo LICONN (konektomika temeljena na svjetlosnoj mikroskopiji). Naši kolege iz ISTA vodili su ključnu inovaciju projekta – protokol koji fizički proširuje mozak dok čuva strukturalnu integritetu, a istovremeno hemijski označava sve proteine kako bi pružio kontrast slike za praćenje neurona i otkrivanje drugih ćelijskih struktura kao što su sinapse. Iterirali smo s ISTA na detaljima protokola, primjenjujući naš skup alata za analizu slika i strojno učenje (ML) za konektomiku, a na kraju potvrđivali LICONN na velikoj skali pružajući automatiziranu rekonstrukciju skoro milijun kubičnih mikrona volumena mišje kore. Zatim smo potpuno potvrdili pratljivost svih ~0,5 metara neurita pakiranih u manjem volumenu mišje hipokampalne tkiva, pokazavši da LICONN jednako dobro radi kao i elektronska mikroskopija temeljena na konektomici. Također smo pokazali da LICONN omogućuje istovremeno mjerenje strukturalnih i molekulskih informacija u uzorku tkiva, što će omogućiti fundamentalno nove mogućnosti za razumijevanje rada mozga. Konektomika koristi mikroskopsku snimku temeljenu na optici, spojenu s računalnom obradom, za rekonstrukciju pojedinačnih stanica i njihovih složenih veza unutar mozga. Potreba za novim pristupima Elektronske mikroskopi proizvode slike na temelju toga kako se zrak elektrona raspršuje kada interagira s uzorkom, omogućujući im da imaju mnogo veću razlučivost od svjetlosne mikroskopije – može snimiti značajke na skali nanometra u odnosu na stotine nanometara za (vidljivu) svjetlosnu mikroskopiju. Iako svjetlosna mikroskopija ima ograničenu razlučivost, njena dostupnost je velika prednost. Elektronske mikroskopi koje se koriste za istraživanje konektomike mogu koštati milijuna dolara, a njihovo funkcioniranje zahtijeva proširenu specijaliziranu obuku, čime su često dostupne samo neuroznanstvenicima u velikim, dobro financiranim institucijama. Istraživači su koristili nekoliko “super-razlučivih” svjetlosnih mikroskopskih tehnika, koje mogu snimiti izvan granice difrakcije svjetlosti za postizanje nanorazlučivosti, da označe i prate relativno male podskupove neurona na različite načine. Ali ove tehnike nisu uspjele postići “gustu” konektomiku – tj. kartiranje svih gusto pakiranih neurona na razini najfinijih vlakana. Ključna prednost svjetlosne mikroskopije je da može uhvatiti svjetlost na mnogim različitim valnim duljinama, tako da istraživači mogu koristiti za vizualizaciju raznobojnih fluorescencijskih markera za proteine, neurotransmitere i druge molekule koje pružaju tragove o tome kako neuroni i krugovi funkcioniraju ili ne funkcioniraju. LICONN omogućuje da se ovi molekulski markeri poravnaju s detaljnim strukturalnim kartama neuronalnih puteva s neprethodnom preciznošću i lakoćom, što će pomoći u dobivanju važnih informacija.

Prednosti i nedostaci svjetlosne mikroskopije

Prednosti

– Dostupnost: Svjetlosna mikroskopija je mnogo pristupačnija i dostupnija od elektronske mikroskopije, što omogućuje većem broju istraživača da je koriste.
– Široka primjena: Može se koristiti za vizualizaciju raznobojnih fluorescencijskih markera, pružajući bogat skup podataka o funkcionalnosti i strukturi neurona.
– Kost-efikasnost: Ne zahtijeva visoko specijaliziranu opremu, čineći je pristupačnijom i ekonomičnijom za manje institucije.

Nedostaci

– Ograničena razlučivost: Usporedno s elektronskom mikroskopijom, svjetlosna mikroskopija ima ograničenu razlučivost, što može ograničiti njenu sposobnost da detaljno snimi strukture na nanometarskoj razini.
– Ograničene tehnike: Postoje ograničenja u tehnikama super-razlučivosti svjetlosne mikroskopije, što može ograničiti njenu sposobnost da snimi sve neurone u gustim područjima.

Primjene svjetlosne mikroskopije u neuroznanosti

Kartiranje mozga

Svjetlosna mikroskopija je ključna u kartiranju mozga, omogućujući istraživačima da detaljno proučavaju strukturu i funkciju neurona. LICONN, na primjer, omogućava automatiziranu rekonstrukciju velikih volumena mozga, pružajući detaljne informacije o strukturi i funkcionalnosti neurona.

Dijagnostika bolesti

Svjetlosna mikroskopija igra važnu ulogu u dijagnosticiraju mnogih neuroloških bolesti. Njenom pomoću, istraživači mogu identifikovati i karakterizirati abnormalnosti u tkivima, što je ključno za razvoj novih dijagnostičkih i terapijskih metoda.

Razvoj novih lijekova

Korištenje svjetlosne mikroskopije u razvoju novih lijekova omogućava istraživačima da proučavaju kako se lijekovi utječu na strukturu i funkciju neurona. Ovo je ključno za razvoj novih lijekova koji mogu učinkovito liječiti neurološke bolesti.

Zaključak

Svjetlosna mikroskopija ostaje neprocjenjivim alatom u istraživanju živih organizama, uključujući i neuroznanost. LICONN predstavlja revolucionarni korak naprijed, omogućujući detaljno kartiranje mozga pomoću svjetlosne mikroskopije. Ova metoda ne samo da je pristupačnija i ekonomičnija od elektronske mikroskopije, nego i pruža bogat skup podataka koji može značiti fundamentalne promjene u razumijevanju mozga.

Česta pitanja

Koje su prednosti svjetlosne mikroskopije u odnosu na elektronsku mikroskopiju?

Svjetlosna mikroskopija je mnogo pristupačnija i dostupnija od elektronske mikroskopije, što omogućuje većem broju istraživača da je koriste. Također, može se koristiti za vizualizaciju raznobojnih fluorescencijskih markera, pružajući bogat skup podataka o funkcionalnosti i strukturi neurona.

Može li svjetlosna mikroskopija zamijeniti elektronsku mikroskopiju u neuroznanosti?

Svjetlosna mikroskopija ima ograničenu razlučivost u usporedbi s elektronskom mikroskopijom, što može ograničiti njenu sposobnost da detaljno snimi strukture na nanometarskoj razini. Međutim, LICONN predstavlja revolucionarni korak naprijed, omogućujući detaljno kartiranje mozga pomoću svjetlosne mikroskopije.

Koje su primjene svjetlosne mikroskopije u neuroznanosti?

Svjetlosna mikroskopija ima širok spektar primjena u neuroznanosti, uključujući kartiranje mozga, dijagnostiku bolesti i razvoj novih lijekova. LICONN, na primjer, omogućava automatiziranu rekonstrukciju velikih volumena mozga, pružajući detaljne informacije o strukturi i funkcionalnosti neurona.

Koliko je LICONN dostupan i ekonomičan?

LICONN je pristupačniji i ekonomičniji od elektronske mikroskopije, ne zahtijevajući visoko specijaliziranu opremu. Ovo čini ga pristupačnijim i ekonomičnijim za manje institucije, omogućujući većem broju istraživača da ga koriste.